性别鉴定计

篇一：性别鉴定

PCR性别鉴定实验

摘要：

人类y染色体上特异性重复序列（humany-chromosome specific repetitive DNA family sequence）是一种重复性很高的特异性序列，引物能在人类广大的基因组中对它进行特异性识别，因此，它是良好的PCR材料。本实验通过对人黏膜细胞的DNA提取、基因组DNA制备、PCR扩增y染色体上特异性重复序列、PCR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定。通过此次实验，我们得到了预期结果，只有极少数因实验操作等人为失误导致实验与预期不符的情况发生，总之，用PCR技术扩增y染色体上特异性重复序列的方法是可靠的。

关键词： 基因组DNAPCR y染色体上特异性重复序列电泳检测

引言

PCR（Polymerase Chain Reaction）又称聚合酶链式反应，它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。

鉴定性别方法有很多，巴氏小体观察法、染色体分型技术都可以对人的性别进行鉴定，但是染色体分型需要专门的技术和人才，巴氏小体鉴定人的性别准确率低，而且无法鉴别XXY、X0核型的性别。而PCR的方法操作简单，准确率高。由于Y染色体是区分性别的本质，PCR可以很简便地从基因组DNA中直接获得Y染色体DNA进行分析鉴定。本实验就是通过PCR技术扩增y染色体上特异性重复序列来实现性别鉴定。

人类及哺乳动物的性别决定和分化是一个复杂的过程，涉及已知和未知的多个基因。SRY基因是人类及已知许多哺乳动物中一段Y染色体特异的保守序列，人类SRY编码区全长615bp。该基因的突变将导致XY染色体女性化（特纳氏综合征）；而含有该基因的染色体片段如果易位到X染色体，则导致XX男性综合征。但是由于人类的基因组太大，有700多MB,引物要从700多MB的序列中识别615bp的序列十分困难，因此，本实验选取的是一种更容易被引物识别的序列——y染色体上特异性重复序列（human y-chromosome specific repetitive DNA family sequence）来进行PCR扩增。

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

综上，本实验通过对人口腔黏膜细胞的DNA提取、基因组DNA制备、PCR扩增y染色体上特异性重复序列、PCR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定，取得了良好的效果。

正文

1.材料和方法

1.1 材料和试剂

实验材料：人口腔黏膜细胞

实验试剂：ddH2O、10×Buffer、dNTP(2.5mM each)、PrimerF(10μM)、PrimerR(10μM)、Taq酶（5U/μL）、TAE、EB、agarose,etc.

实验仪器：离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mL Ep管、金属浴锅、制胶槽、制胶板、样品梳等

1.2实验方法

1.口腔上皮细胞DNA样品制备

（1）取一高压过的Ep管，做好标记； （2）取60μL细胞裂解液至一个Ep管中；

（3）先用水漱口，然后用消毒牙签（钝头）刮取口腔上皮，弃去第一次刮取物，保留第二刮取物；

（4）将消毒牙签（钝头）放于Ep管细胞裂解液中快速转动，释放细胞； （5）50℃水浴锅保温20min。

（6）在等待过程中建立PCR反应体系。即取一个干净的PCR管，在冰浴中，依序加入表1中的成分（除了模板以外其他都加好）。另外要设置阴性对照和阳性对照。阴性对照不加模板，阳性对照加入男性基因组DNA。

（7）95℃金属浴保温除模版外PCR反应体系10min。

（8）12,000rpm离心除模版外PCR反应体3min，获得DNA溶液。

（9（10）将样品放入PCR仪中，按照表2的PCR反应条件进行目的片段DNA扩增。

2.1.2%的琼脂糖凝胶电泳

（1）正确组装1套制胶槽、制胶板、样品梳（使用2排25齿的梳子）。

（2）取80mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.96g琼脂糖，倒入瓶中，轻旋混匀。轻

旋瓶盖，放入微波炉中加热沸腾3～4次，至溶液澄清无颗粒。

（3）待溶液冷却至60℃左右，加入40μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5μg/mL，轻旋混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固（冷却凝固时间要在30min以上）。

（4）在20μL PCR反应液中加入4μL上样缓冲液，用微量移液器吹吸混匀。

（5）将凝胶中的梳子轻轻拔出，将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至高出胶面约1mm。

（6）将上述混合好的DNA样品，按照表3的顺序，点样到凝胶中。

（7）开启电泳仪电源 。

（8）选择合适的电压（100V）和时间（20min）。

（9）将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。

（10）启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。

（11）电泳结束，关闭电源，取出凝胶,紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。

2．结果

Y染色体特异性重复序列烦人DNA的PCR扩增电泳结果如图1所示。

图1-11.2%的琼脂糖凝胶电泳图（1组至6组）

图1-2 1.2%的琼脂糖凝胶电泳图（7组至10组）

图1-1的泳道1、泳道23、图1-2的泳道1、泳道16加的是DL2000 DNA marker，起指示DNA条带的作用。DL2000 DNA marker的条带大小由上至下分别是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp。由于点样时间太长，图1-1泳道1和图1-2的泳道1的DL2000 DNA marker样品弥散了，因此在图中没有显示出来。

图1-1的泳道2、13，图1-2的泳道5是加入的样品是阴性对照，阴性对照组PCR反应体系不加模版，在100bp处有引物多聚体的条带，对女生的电泳结果起对照作用。

图1-1的泳道12，图1-2的泳道15是加入的样品是阳性对照，在299bp处有条带，能对男生的电泳结果起对照作用。

除DL2000 DNA marker的上样孔外，其他上样孔在100bp处都有或深或浅的条带，此处的条带是引物自身配对所形成的引物多聚体，条带深可能是因为：①上样量相对较多；②所配总反映体系时没有充分混匀，导致分装过程中引物含量相对较多；③引物自身形成二聚体的量过多。条带浅可能是因为：①上样量相对较少；②所配总反映体系时没有充分混匀，导致分装过程中引物含量相对较少；③引物自身形成二聚体的量过少。

女生的上样孔为图1-1的泳道4、6、8、10、14、15、17、20、22和图1-2的泳道2、3、6、7、8、10、11、14。所有的上样孔在100bp附近都有条带，是由于形成了引物多聚体。图1-2的泳道6、7、8、10、11、14除了在100bp处有条带之外，在其上方也有较弱的条带，可能是操作过程中引入了DNA杂质而导致样品不纯。

男生的上样孔为图1-1的泳道3、5、7、9、11、16、18、19、21和图1-2的泳道4、9、12、13。除泳道16外，其他上样孔在250bp靠上的位置均存在299bp的条带，有的条带深有的条带浅，可能是由于在取样过程中用牙签刮取的口腔上皮细胞量不同，导致所提取的DNA量不同，PCR扩增的片段的量也就不同了，也有可能是上样过程中点样量存在差异而导致最终条带亮度不同。男生的泳道也均会形成100bp大小的引物多聚体。泳道16没有299bp的条带可能是因为DNA模版没有加进PCR反应体系。

我的上样孔为图1-2的泳道7，存在100bp左右的引物多聚体，我的条带较浅是因为点样过程中样品点漂了；由于我的条带较浅，我的杂质也不太明显。

3.讨论

1.在建立PCR反应体系的时候，每桌可配成master后分装，这样可以保证加样量比较均一和准确，此外，每桌设置一个阴性对照和一个阳性对照。

2.女生注意保护好样品，以免样品被污染使电泳结果不准确。

3.PCR的反应条件有三个值需要人为设定，分别是复性温度（X℃）、延伸时间（Y s）、和循环次数（Z Cycles）。复性温度（X℃）由片段复杂程度决定的，片段复杂程度越高，复性温度越高。延伸时间（Y s）取决于目的基因的长度，目的基因越长，延伸时间越长。对于循环次数（Z Cycles），循环次数越多DNA浓度越高，循环次数越少DNA浓度越低。

4.本实验PCR的人类Y染色体特异重复序列的最终产物大小是299bp，而前引物序列为 ttccaatccattcctttcctttcgcttgc，序列长度是28bp，Tm值是54.96℃；而后引物序列为

ggatagtaatggactggagtgaaatggac，序列长度是29bp，Tm值是55.05℃。因此，我们扩增的片段实际大小为242bp(299-29-28=242)。

5.引物时应避免一下几个方面：①避免引物多聚体的形成：尽可能避免两引物的3’端有较多碱基互补，引物二级结构的存在可能影响其与模版的特异结合和有效结合；②避免发夹结构的形成：避免引物3’端形成发夹结构；③引物3’端的选择：引物3’端需与模板DNA严格配对，不能有任何修饰，3’端的错配则会影响DNA聚合酶的有效起始；最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对；最后1～2个碱基（nt）最好不要用T/A，因为T/A之间只有两个氢键，引物与模版结合不牢固。④避免引物在模版内部的错配：引物在模板内应具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低，目的产物带将减少。可以在引物设计好后，最好做blast检测，检查同一物种基因组中是否存在高度同源序列。

6.引物5’端可引入与模板DNA不配对的碱基，如：①限制性核酸内切酶识别序列，以方便克隆操作；②各种寡核苷酸接头；③可改变某个碱基，从而在产物中引入点突变；④可利用放射性或非放射性物质（如生物素、地高辛等）进行标记，以方便后续分析、检测。

7.引物设计时应该把握以下几点：①引物长度一般为15-30nt：某些长的PCR片段和特殊的PCR片段需要更长的引物，引物越长，与模版结合的特异性也就越好，但是引物过长，包含的碱基越多，发生错配的概率就越高，通常更易于形成包括发卡结构、二聚体自身互补等二级结构。，此外，引物过长会导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。如果引物太长就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体；②引物GC含量在40%~60%之间：GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大，因为引物的Tm值与GC含量密切相关，GC含量相差太大不好设置退火温度；③Tm值最好接近72℃：Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般低于Tm值5℃.若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳；④碱基要随机分布：同一碱基不应连续超过4个，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区

篇二：胎儿性别鉴定

胎儿性别鉴定

与性别相关的遗传疾病， 一些可能只出现在男性胎儿中，而还有一些可能只出现在女性胎儿中。因此对于可能有这类遗传疾病史的家庭，早期鉴定胎儿性别将有利于制定最终基因检测。过去，胎儿性别鉴定经常使用介入性早孕期诊断方法，比如绒毛活检。由于采用怀孕组织直接取材，介入性早孕期诊断的准确率很高。但是，因为诊断过程需要用针头刺人子宫内取样，这种手术有可能导致流产。

超声波诊断也可以用于胎儿性别鉴定， 但是它只能对妊娠中期的胎儿性别做出准确鉴定。而对于诊断与性别相关的遗传疾病，基因检测计划得制定需要在早孕期鉴定胎儿性别，因此，在这种情况下，超声波检测并不是一个很好的方法。

什么是细胞游离 DNA (ffDNA)？

DNA是一种存在于人体每个细胞内的遗传信息材料。DNA可以被划分为很多区间结构被称为基因，而这些基因则决定了人的特征，比如说头发和眼睛的颜色以及一些其它遗传标志。ffDNA 是一种自于胎儿的遗传信息材料，但是在妊娠期间，ffDNA可以在母亲血液中被检测到。到目前为止，胎儿的DNA (ffDNA) 是如何进入母体血液内的仍然是一个谜。但是，科学家已经发现从怀孕第6星期到生产之后两小时，ffDNA都可以在母体内检测到。

如何利用ffDNA鉴定胎儿性别？

当怀孕超过7周时，就可以采集母体血液样本。科学家将采用先进的技术，在母体血液样本内寻找只存在于男性体内的遗传信息如SRY或者DYS14。因为这些基因只存在于男性体内，如果它们中的任何一个被检测到都意味着胎儿是男孩。反之，如果这些基因没有一个被检测到则意味着胎儿有可能是女孩。就目前我们的实验结果证明，妊娠8周后母体血液内的ffDNA在正常条件下足以进行性别鉴定而且结果是可信的并达到高峰值，准确率达到百分之九十八。

我公司可以协助安排相关事宜，服务如下：

1） 预约香港检测中心与产科教授

2) 产前胎儿性别鉴定与孕妇产检

3） 陪同完成医疗检查过程；

4） 快递化验上门

篇三：医学需要胎儿性别鉴定管理制度

医学需要胎儿性别鉴定管理制度

一、 凡拟诊为伴性遗传性疾病的孕妇，需要做胎儿性别鉴定者，必须经县级以上医疗保健机构确诊后，正式填写申请表一式二，申请胎儿性别鉴定。

二、 申请鉴定人在鉴定前应携带以下资料到市以上卫生行政部门办理鉴定手续：

1、 县级以上医疗保健机构出具的伴性遗传性疾病证明（盖有单位公章）。

2、 被鉴定人的有效身份证。

3、 被鉴定人所在单位（或乡镇政府、街道办事处）介绍信。

4、 县以上计划生育行政部出具的准生证。

5、 市计划生育行政部门出具需做胎儿性别鉴定的证明。

三、 经市卫生局同意后，到九江市妇幼保健院进行胎儿性别鉴定。

四、 九江市妇幼保健院在实施医学需要的胎儿性别鉴定前，要经院长或分管院长批准后，方可实施。

五、 该院在鉴定工作完成后，应出具《胎儿性别鉴定证明》一式三份，并加盖公章，一份提供给被鉴定人，一份供鉴定机构存档，另一份送市卫生行政部门备案。同时通报市计划生育行政部门。

推荐访问:鉴定 性别

---