海南岛南繁区棉花根结线虫病发生情况调查及综合防治

工作带来一定的困难，如根结线虫。根结线虫是一类在经济上极为重要的植物专性寄生线虫，广泛分布于世界各地，在35°S和35°N之间的地区分布最多[1]。目前根结线虫已报道有90多个种，但是Karssen认为81个为有效种[2]。根结线虫是普遍而重要的农作物病原线虫，一般造成农作物减产10%～20%，严重的达75%以上。常见的4个种根结线虫最具危害性，在根结线虫所引起的整个栽培作物的损失中，它们造成的损失占90%以上[3]。由根结线虫引起的棉花病害称棉花根结线虫病，是一种世界性病害，目前在许多产棉国家都有发生，不仅直接影响原棉的产量与品质，而且导致枯萎病菌的侵染，造成更严重的损失。据调查南繁区部分棉花上已受到根结线虫严重危害，这给育种工作带来了严重威胁。

棉花根结线虫病是一种隐蔽性极强的病害，不易被人们所发现，当棉花受到根结线虫为害时，地上部表现出黄叶现象，种植户一般认为是缺肥所引起的黄叶现象，不引起重视。根结线虫侵染棉花根部后形成根结或根瘤，影响水分和养分的吸收，棉花受根结线虫为害严重时，会引起棉花减产，而棉花是我国部分地区经济的支柱产业之一，是农民的主要经济来源。本研究对我国南繁区棉花种植地进行根结线虫病调查，鉴定根结线虫种类，并提出该病的综合防治措施，为南繁区棉花的育种工作奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年3月至2015年4月，在南繁区主要棉花育种基地南滨农场和师部农场，进行棉花根结线虫病调查和样本采集。共调查10个棉花种植地，采集样本10份。采集的线虫样本分别进行单卵块接种于预先培植于消毒土的感病品种番茄根上，进行活体保存，待用。

1.2 方法

1.2.1 棉花根结线虫病为害调查及样品采集

在海南岛南繁区南滨农场和师部农场的棉花育种基地选择10个调查点，其中南滨农场4个调查点（标记为A、B、C、D），师部农场6个调差点（标记为A、B、C、D、E、F）。用5点法调查棉花根结线虫病，并采集棉花根系及根周围5～20 cm深的耕作层土壤。样品用塑料袋包装并保湿，同时在标签和记录本上简要注明采集时间、地点、寄主名称、土壤类型和前茬作物等。挖取植株侧根，观察根部症状，根据根结的有无判定植株是否发病，记载田间植株的发病程度；根结线虫病病级分级标准：0级，无根结；1级，根结数占全根系的1%～25%；3级，根结数占全根系的26%～50%；5级，根结数占全根系的51%～75%；7级，根结数占全根系的76%～100%。根结指数=∑（各级病株数×相应级数值）×100/（调查总株数×7）[4]。

1.2.2 棉花根结线虫种类鉴定

形态学鉴定：会阴花纹的制作及观察。用挑针在体视显微镜下解剖根结，每个种群挑取20头成熟雌虫移入硬塑料板上的清水滴中，修切后剔除杂物，并用清水清洗3次，然后将包含完整会阴花纹的角质膜转移到载玻片上，加盖玻片。干燥后在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并拍照。

同工酶分析：运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。电泳分析采用北京六一仪器厂生产的DYY-6B型电泳仪，7%分离胶和4%浓缩胶，每孔加入20头纯化培养的幼龄雌虫酶提取物。酯酶染色参照胡凯基[5]的方法。与已鉴定的爪哇根结线虫（M. javanica）样本作为参照系。酯酶表型的命名按照Esbenshade等[6]的方法。

2 结果与分析

2.1 为害情况及样品采集情况

棉花根结线虫病的症状：发病初期，地上部症状不甚明显，随着根结线虫侵染危害的加剧，地上部病状逐渐显现出来，而且叶色发黄，花铃既少且小。棉花播种一个月后，根上产生不规则的根结，根结是因侵入根内根结线虫的刺激，致棉花根的细胞不断分裂、体积不断增大形成的（图1）。根结的大小与棉花品种感病性及侵入线虫数量有关。新根上根结单个或呈念珠状串生，须根稀疏；老根重复侵染，形成较大的不规则瘤状突起，初期呈白色，后期变黑，腐烂，易脱落，裸露出白色的木质部。在显微镜下，剥开根结或瘤状突起，可见白色、球形或洋梨形根结线虫雌虫，或有线形雄虫或幼虫从根部游离出来。在线虫侵染的根结处，致维管束中断，影响水分和养分的吸取及输送，造成叶片变黄、植株矮化，并易招致一些土壤习居菌的侵染，气温高时，病株易萎蔫。

2014年5月份在南繁区棉花主要育种基地南滨农场和师部农场共调查了10个种植地，发现有4个种植地有根结线虫为害，其中南滨农场B 棉花根结线虫病发病程度为1级，病情指数为14，200 g土中根结线虫二龄幼虫（J2）数为32头；南滨农场C 棉花根结线虫病发病程度为3级，根结指数为29，J2 幼虫为47头。师部农场A 棉花根结线虫病的发病程度为3级，根结指数为29，J2 幼虫数为40头；师部农场D 棉花根结线虫病发病程度为1级，根结指数为11，J2 幼虫数为26头，详见表1。2015年3月份调查10个相同种植地，同样发现有4个被根结线虫为害。发病程度和根结指数没有明显的变化，只有师部农场A棉花的根结线虫病发病程度由原来的3级降为1级，根结指数由原来的29降为14。2015年3月份采集的样品中J2幼虫均比2014年5月份采集的样品少，可能是因为2014年5月份采集的时候已经是棉花的生长尾期，根结线虫产的卵已经有大部分孵化出J2幼虫，而2015年3月份采集时棉花生长还旺盛，根结线虫产的卵还少，孵化出J2幼虫少。

2.2 棉花根结线虫种类鉴定

2.2.1 形态学鉴定

10个根结线虫种群会阴花纹的主要特征较一致，主要表现在整体呈椭圆形或方形，背弓顶部圆或平，有时呈梯形，背纹紧密，背面和侧面的花纹从波浪形至锯齿形，有时平滑。见图2。与有关文献对比分析，初步确定为南方根结线虫。

2.2.2同工酶分析

对纯化培养的根结线虫种群的幼龄雌虫的酯酶进行电泳分析，经酯酶的特异性染色后（图3），参照Esbenshade et al.的研究报道，10个种群的酯酶谱型均为I1型，结合形态学结果，确定这10个根结线虫种群为南方根结线虫。

3 棉花根结线虫病综合防治

南繁区是我国棉花育种基地，由于南繁区属亚热带地区，一年四季均适宜根结线虫的生长繁殖，没有越冬现象，所以出现世代重叠，大量繁殖迅速。再加上育种基地一般是年复一年重复培育相同的作物，这也是根结线虫病发生的一个主要因素。根结线虫不仅引起的棉花根结线虫病，而且诱致枯萎病菌的侵染，严重影响棉花种子质量，造成严重的损失。根结线虫综合治理作为棉花生产技术系统中的一个重要组成部分，在棉花育种过程中具有举足轻重的作用。棉花根结线虫综合治理必须遵循“预防为主，综合防治”的植保工作方针，树立公共植保，绿色植保的新理念。而棉花根结线虫的综合防治主要包括农业防治、生物防治、物理防治和化学防治。

3.1 农业防治

清除病残体、深耕晒垡：在播种前，做好田园卫生是必不可少的。棉花拔柴后，及时烧毁，要彻底清除病残体，减少病原。利用南繁区阳光充足的自然条件，深耕晒垡，特别是夏季，应反复犁耙土壤，把线虫翻至土表，暴晒一个月可明显降低根结线虫J2幼虫的虫口数，减少侵染源。

选用无病种子：种子的筛选和处理是非常重要的，应选用不带根结线虫病病原的种子，根结线虫的虫瘿明显比棉花的种子小得多，利用筛选可达到一定的防治效果；在播种前用50～60℃的温水浸种10 min，可达到杀死大多数根结线虫的作用。

栽培管理：在棉花生长期增施有机肥对棉花的生长非常有利。有机肥施入土壤以后经微生物分解和物理化学变化可形成腐殖质，腐殖质可以改善土壤结构，吸附土壤溶液中多种养分，从而提高土壤保肥、保水的能力，促进根系生长，提高树体的抗病性。其次，增施有机肥能促进土壤中微生物的活动，增加土壤拮抗微生物的生长繁殖，有利于降低根结线虫虫口密度。再次，有机肥在分解时产生有熏杀作用的气体、热量及其产物，对线虫有毒害或伤害作用。有机肥主要有堆肥、鸡粪、猪粪等，也可施用蟹壳粉、骨粉、黄豆粉等有机添加物。蟹壳粉∶堆肥=1∶20的比例施于土壤中，可有效地控制棉花根结线虫病的发生，棉花产量可提高20%左右，因为蟹壳粉能诱发大量分解几丁质类的微生物繁殖，该微生物能有效地分解线虫卵壳，使之不能孵化，达到降低线虫虫口密度的目的。

在使用有机肥的同时可施用少量的化肥，更有利于棉花的生长。施足底肥，以有机肥为主，花铃期及时追肥，满足磷钾肥。灌溉对棉花生长特别有利，适当灌溉对棉花的正常生长是必不可少的，但水分过多易使肥料流失，同时造成烂根。

轮作：轮作是指在同一块田地上有顺序地在季节间和年度间轮换种植不同作物或复种组合的种植方式。是用地养地相结合的一种生物学措施。有利于均衡利用土壤养分和防治病、虫、草害；能有效地改善土壤的理化性状，调节土壤肥力。南繁区棉花育种基地可通过栽培抗根结线虫棉花品种，或与免疫或高抗植物交替种植，或进行水田与旱地交替耕作均能达到控制棉花根结线虫病的效果。

3.2 生物防治

相对根结线虫而言，用于生物防治的生物十分有限。目前已经有一些生物进行田间测试甚至已经商业化，但是还没有一种广泛使用的有效生物。其中目前使用较多的有穿刺巴斯德杆菌和淡紫拟青霉。穿刺巴斯德杆菌的内保字可以黏附在根结线虫的表皮，对根结线虫有一定的专化性。淡紫拟青霉在世界范围内分布，在温暖的地区尤其多，以腐生的方式存在，能在土壤中竞争利用一系列底物，目前已成功运用于控制根结线虫。在棉花生长期，根结线虫侵染初期使用淡紫拟青霉控制根结线虫，可达到一定效果。

3.3 物理防治

首先是棉花种子的选育，根结线虫虫瘿比棉花种子小，可通过筛选机筛选除去种子中的虫瘿，筛选效果可达90%以上；其次是温汤浸种，在通常情况下，40～45℃温水浸种15 min，可杀死大多数根结线虫[7]；第三是土壤热处理，利用南繁区的高温条件，深耕晒垡，把线虫翻至土表暴晒，可减少根结线虫侵染源。

3.4 化学防治

棉花播种前可用熏蒸性药剂进行土壤熏蒸，如可用10%噻唑膦颗粒剂、0.5%阿维菌素颗粒剂或5%丁硫克百威GR对种植穴土壤进行消毒；也可按45 kg/hm2的剂量用35%威百亩水剂兑水300 kg沟施和覆土，并用地膜覆盖熏蒸7 d后，翻土释放毒气后方可播种。在棉花生长过程中，如发现有根结线虫病为害时，可以选用低毒、高效杀线虫剂防治，施药次数视线虫虫口密度而定，如可用噻唑膦颗粒剂、地虫克颗粒剂、好年冬颗粒剂、阿维菌素乳油或菌线威可湿性粉剂等进行沟施或灌根。沟施时可在沟里撒上10%噻唑膦颗粒剂30 kg/hm2，然后覆土。灌根时可选用1.8%阿维菌素乳油1 500倍灌根或1.5%菌线威可湿性粉剂4 000～6 000倍液灌根即可。

4 讨论与结论

在本次调查试验中，南繁区棉花种植过程中发现受根结线虫为害的比率占40%，发病程度最高为3级，根结指数最高为29。目前据调查显示棉花根结线虫病虽然还没有明显的影响棉花的正常生长，但南繁区是我国棉花育种基地之一，复种指数高，这将有利于根结线虫的大量生长繁殖，在这种高复种指数下根结线虫病很快会成为棉花种植的一大病害，不容忽视。在调查过程中发现，南繁区棉花根结线虫病的发生不仅与选育的棉花品种有关系，还与是否使用杀线剂有很大的关系。

通过形态学观察和同工酶分析，鉴定棉花根结线虫为南方根结线虫。棉花根结线虫病在国内报道甚少，这和该线虫是一种隐蔽性极强的有害生物有关外，可能还与人们对线虫的认识不够，在线虫为害初期，地上部分表现出的黄叶，一般情况下人们都误以为是缺水缺肥所引起的黄叶。

南繁区是我国棉花主要育种基地，要想其可持续的被用于育种，在种植管理过程中就要注意病虫害的防治，其中根结线虫病的防治就是棉花种植过程中的一大难题。棉花根结线虫病的综合防治是棉花育种过程中必不可少的一部分。在以往的根结线虫病防治上主要是以化学药剂为主，而化学药剂是引起农业生态环境恶化的主要原因，不符合农田可持续发展的要求。在未来的棉花根结线虫病管理体系中，应充分发挥农田系统中自然因素的生态调控作用，主要使用农业防治、生物防治、物理防治和化学防治相结合的综合防治方法，以取代目前以化学防治为主的防治方法。

参考文献

[1] 汪来发，杨宝君，李传道. 华东地区根结线虫的调查[J]. 林业科学研究，2001，14（5）：484-489.

[2] Krssen G. The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Goldi，1892 （Tylenchida） in Europe. Gent Belgium ： University of Gent， 1999： 1-161.

[3] 杨宝君. 十五种根结线虫病害的病原鉴定[J]. 植物病理学报， 1984， 14（2）： 107-111.

[4] GB/T17980.38—2000，农药，田间药效试验准则（一）[S]. 中国标准出版社，2000：156-160.

[5] 胡凯基. 醋酶在根结线虫分类上应用的研究[J]. 林业科学研究，1988（6）：650-656.

[6] Esbenshade P R， TriantaPhyllou A C. Use of enzyme phonotype for indentification of Meloidogyne species[J]. Joumal of Nematology， 1985， 17： 6-20.

[7] 刘维志. 植物病原线虫学. 中国农业出版社[M]. 2000： 363.

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