药学论文：广金钱草种质资源评价与遗传多样性分析

药学论文：广金钱草种质资源评价与遗传多样性分析

前 言

肾结石通常的治疗方法根据结石的大小有不同的治疗方案，对于较大（0.6cm~2 cm）的结石通常采用体外碎石法治疗，对于直径较小（小于 0.6 cm）的结石则通过大量饮水或通过服用药物的方法进行治疗。目前市面上所售卖的排石中成药种类较多[6]，如尿石通丸、石淋通片、结石通片等药物，这些中成药中均以广金钱草为主要中药进行组方，有文献显示广金钱草中黄酮类的化学成分可抑制或在一定程度上溶解结石，通过尿液将小粒径的结石排出。应武汉人福药业委托，协助人福药业中药研究院广金钱草课题组完成“广金钱草总黄酮软胶囊”研发工作。

中药材、中药饮片与中成药的多以有效成分的含量为评价指标，有效成分含量的高低将影响到相关疾病的治疗效果。影响药材质量的因素很多，种植的地域、种植方法、采收的时间都会影响到药材的质量与产量。武汉人福药业与本实验课题组成员所采集的样品共计 23 个产地、从2011~2013 年不同采收时间的药材样本，按照药典的方法对这些药材制备成供试品溶液，用高效液相色谱法对广金钱草样品的化学成分进行分析，以黄酮类成分的含量为基础，通过其化学成分指纹图谱研究其成分结构来评价其药材及其制剂质量的真实性、稳定性以及优良性。

本研究同时采用了分子生药学的方法，运用 ISSR-PCR 技术对不同产地的广金钱草的亲缘性进行分析。ISSR(inter-simple sequence repeat)技术于 1994 年发展起来的一种分子标记的方法[17]。通过 ISSR 技术对产于广东省、广西壮族自治区的栽培、野生及半野生广金钱草在 DNA 分子水平上的遗传变异进行研究，在 DNA 分子水平上分析广金钱草的遗传多样及其亲缘性。

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第一章 广金钱草的种植生产情况

1 广金钱草生态习性及生物学特性

1.1 生态习性

广金钱草通常生长在气候温和、有充足降雨量的中国南方地区，生长旺盛时期在每年 6 月至 9 月，属于南方高温季节。根据采样时期间的天气情况，日平均光照超过 10 小时，气温超过 25℃，且湿度超过 70%。野生广金钱草主要生长在海拔 100~1000 m 的丘陵或山坡的向阳面，在路边、灌木丛中也可发现野生广金钱草，可适应较为贫瘠的土壤中，生命力较为顽强。采样过程中发现，人工培育的广金钱草多生长在丘陵地带间的平地中，种植面积最大的广西壮族自治区临桂的药材生长在黄沙质的土壤中，而广东省湛江市遂溪县的广金钱草种植在红沙质的土壤中，生长情况都很好，产量也很高。

1.2 生物学特性

广金钱草属于豆科草本植物，茎匍匐生于地面，成熟广金钱草茎为圆柱形，表面为淡棕色，密被绒毛，断面为黄白色，长约 0.5 m~1.2 m，茎粗约 0.5 cm~0.8 cm。叶互生，纸质，叶圆形，主脉明显，顶端或有微凹，基部心形，直径 2 cm~4 cm，叶面无毛，背面密被白色绒毛。总状花序，花较小，为蝶型花，香气较淡，卵性包片，被绒毛。果实为线状长圆形的荚果，被短绒毛，内有数枚肾形种子。花期为每年 9 月左右，果期在每年10 月左右[9]。

每年 4 月初开始播种，5~6 月侧蔓开始萌生，匍匐在地面生长。主蔓的基部及节间能生长出不定根，并能形成较长的根系。7 月生长速度极快，8 月则可收割药材，此时药材质量最好，9 月~10 月开花、结果后药材质量有所下降。10 月底至 11 月初，广金钱草植株开始枯萎落叶，以宿根方式越冬。需特别说明的是，人工培养的广金钱草在 8 月初会收割一次，收割后立即施复合肥，在 10 月中旬可收割第二季。

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2 种植生产规模

本实验所采集到的样品主要来自广东省与广西壮族自治区。广西壮族自治区中庸县及临桂县为目前最大的广金钱草种植地，中庸县与临桂县相距很近，两地均有长期种植广金钱草的历史，2010 年种植面积及产量最高，产量达 5000 吨左右，近年来药材价格降低，导致种植面积减少，目前产量稳定在 2000 吨。玉林市是广西广金钱草的主要产地之一，分布在玉林市所属的县、镇，种植方式主要是农户散种，并没有形成一定规模，年产量约 100 吨。遂溪县是广东广金钱草的主要产地，遂溪县的城月镇与乌塘镇种植广金钱草产量约 300 吨。除这些地方以外，广东、广西的县级城市的少量农户会种植一些广金钱草作为收入来源。各地的广金钱草种植方式有所不同，主产区临桂县与中庸县有较为统一的人工种植方法，其他产区的种植方式较多，套种、间作现象都有，没有统一的规范化种植方案，药材的质量也参差不同。

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第三章 广金钱草药材指纹图谱及主成分分析........ 17

1 引言.......................................... 17

2 实验材料与仪器试剂 .......................... 17

第四章 广金钱草遗传多样性 ISSR 分析............. 40

1 引言......................................... 40

2 仪器与试剂 ................................... 40

结 语 .......................................... 50

第四章 广金钱草遗传多样性 ISSR 分析

1 引言

文献中关于分子标记技术对广金钱草的报道较少[15,16]， 均使用 ALFP 技术对广金钱草或同属植物遗传多样性进行研究，而采用 ISSR 分子标记技术对广金钱草遗传多样性的研究未见报道。ISSR 技术是 Ziekienlcz[17]在 1994 年建立的一种操作简单、多态性及重复性较好的分子标记技术，目前已广泛应用于药用植物的遗传多样性及亲缘关系的研究。本章节采用 ISSR 技术，研究广东、广西栽培种、半野生种及野生种广金钱草在分子水平上的遗传变异，旨在揭示广金钱草遗传结构和遗传多样性水平，为广金钱草遗传资源的保护提供依据。

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2 仪器与试剂

2.1 供试品材料

广金钱草新鲜叶片（由湖北中医药大学陈科力教授鉴定为广金钱草的嫩叶叶片）于 2014 年采集于广东省、广西壮族自治区的 15 个不同地区的居群（表 3-1）。采样时用清水洗净叶面上的灰土并擦干，用滤纸包裹放入吸水硅胶中封存，放入-4 ℃冰箱中保存。

2.2 试剂

采用改良的 CTAB 法提取[18]，2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲溶液，RNase (sigma 公司) ，Taq DNA Polymerase (Vazyme 公司) ，10×Taq buffer(Mg2+Free，Vazyme 公司) ，MgCl2溶液 (Vazyme 公司) ，dNTP Mixture (上海生工) ，Sybra Green I，琼脂糖凝胶(上海捷瑞生物工程有限公司)，ISSR引物(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，饱和酚、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、氯仿为国产分析纯，超纯水。

2.3 仪器

高速冷冻离心机(5424R，德国 Eppendorf)，梯度 PCR 仪（德国BIO-RAD），电泳仪（北京君意公司），暗箱式紫外分析仪 WFH-203B（上海精密仪器） ，微量移液器 (Eppendorf)，高温高压灭菌锅（日本松下），恒温水浴锅，电子分析天平（Sartorius BP211D，德国），鼓风干燥箱。

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结 语

广金钱草为广东、广西地区的道地药材之一，为治疗结石类疾病常用中药。野生广金钱草经过人工培育种植后，其产量及质量均得到提高，为中药材规范化、科学化种植提供了有利条件。优良的种质选育是提高药材质量的基础，也是中药材规范化种植、生产的根本。传统的中药材质量评价方式以性状鉴别、显微鉴别、化学成分的含量高低为指标，评价方式较为单一。本课题采用现代科学研究方法，对广金钱草质量及其亲缘性进行分析，为广金钱草的质量评价方法及种质选育打下基础。

通过对广东省、广西壮族自治区的广金钱草种植情况的调查，广金钱草适合在中国南方地区生长，对土壤、海拔的要求不高。从种植规模来看，目前这两个省份的广金钱草已经有较为稳定的种植方式，在主产区桂林市临桂县的药材产量及质量均较稳定。与临桂县的种植情况相比较，其他地区的种植情况主要是根据头一年的收购价格来种植，产量并不稳定。本实验以黄酮类有效成分含量为基础，对夏佛塔苷、异牡荆苷、Vicenin 2、Vicenin 3、异荭草素的含量进行测定，比较外标法及 QAMS法所测定的结果。2015 年版药典规定的广金钱草中夏佛塔苷含量不低于0.13%，本实验所采集的样本的夏佛塔苷含量均高于药典要求，最高达到0.67%。QAMS 法与外标法结果比较显示，QAMS 法可以对广金钱草药材中黄酮类成分的含量进行测定，对其药材及相关制剂的成分可以做到快速、准确测定。

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参考文献（略）

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