紫薯多酚生物活性及体外模拟胃肠消化稳定性研究

摘要：对经树脂纯化后的紫薯游离酚和结合酚提取物分别进行体外清除DPPH自由基及α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。结果表明：紫薯游离酚和结合酚提取物清除DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）分别为0.014 mg/mL和2.020 mg/mL，α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分别为0.160 mg/mL和0.980 mg/mL，说明紫薯多酚提取物具有较强的DPPH自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力；经体外模拟胃消化1 h、肠消化2 h后，游离酚和结合酚含量均下降，且前者下降幅度大于后者。

关键词：紫薯；游离酚；结合酚；DPPH自由基；α-葡萄糖苷酶；体外模拟胃肠消化

中图分类号：TS215 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2018）04-0048-04

多酚是一类含有多个羟基的酚类植物成分的总称，主要包括花色苷、原花色素、黄酮醇类等。多酚在植物体内以游离酚和结合酚两种形式存在，前者为游离型，国内外研究报道较多；后者则是与细胞壁中多糖、蛋白质等结合，以结合型存在，以往在研究中往往被忽略，近些年才逐渐得到关注。大量科学研究表明，植物多酚具有多种生物活性和生理功能，如清除自由基、抗癌、抗辐射、降血脂、提高机体免疫力等。多酚类化合物在人体中发挥其作用前，首先要经过人体胃肠道的消化，所以多酚类化合物的消化稳定性成为当前食品和功能性食品领域研究的热点。例如：Marchese等人研究发现，经胃和十二指肠模拟消化后，绿茶饮料中的单宁类化合物均大幅度降低，且经过胃肠道消化后其抑菌活性消失；Corrê等人研究表明，胃肠道消化过程会大大降低葡萄皮提取物中多酚类化合物的种类和含量，并降低其抗氧化和抑菌活性。紫薯为旋花科番薯属植物，其中富含膳食纤维、淀粉等营养物质，还富含花色苷、绿原酸、类黄酮等多酚类物质。目前的研究主要集中在紫薯花色苷方面，而对紫薯多酚研究较少，特别是结合酚方面研究缺乏。本课题对紫薯游离酚与结合酚的自由基清除活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，以期为将紫薯多酚应用于抗氧化和降低餐后血糖方面提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用甘薯：品种为“辽薯20”，由辽宁省农业科学院提供。

DPPH：TCI公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），α-葡萄糖苷酶：美国Sigma公司；大孔树脂HPD-100：沧州宝恩化工有限公司；无水乙醇、福林酚试剂、氢氧化钠、碳酸钠：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

新阳LG0.2型真空冷冻干燥机：新阳速动设备制造有限公司；电子天平：上海舜宇恒科学仪器有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅、DHG-9070A型恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；CR21G型冷冻离心机：日立有限公司；pH计：上海荣汉自动化仪表有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HL-2型数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物的制备 1） 游离酚与结合酚的提取。取50 g紫薯冻干粉，以料液比 1∶10的比例加入体积分数60%的乙醇水溶液，于50 ℃水浴中放置2 h提取游离酚，10 000 r/min离心20 min，离心后收集上清液，保留滤渣；按上述步骤重复提取2次，至游离酚提取完全，合并上清液即为游离酚粗提液，旋转蒸发去除乙醇后备用。将充分提取游离酚后的滤渣真空干燥至质量恒定，取干燥甘薯渣，以料液比1∶10加入2 mol/L的NaOH溶液，于室温下用磁力搅拌器水解5 h以释放结合酚，水解结束后以10 000 r/min离心20 min，弃去滤渣，收集上清液即为结合酚粗提液。2） 游离酚的纯化。用AB-8大孔树脂进行紫薯游离酚纯化（Φ1.5 cm×40.0 cm）。上样液浓度为1.00 mg/mL，上样液pH值为3.0，上样体积为5.4 BV，解吸液为pH值7.0、体积分数50%的乙醇水溶液（用量6.8 BV），收集解吸液进行真空冷冻干燥，即得到紫薯游离酚提取物。3） 结合酚的纯化。用HPD-100大孔树脂进行紫薯结合酚纯化（Φ1.5 cm×40.0 cm）。上样液浓度为0.25 mg/mL，上样液pH值为3.0，上样体积为3.6 BV，解吸液为pH值5.0、体积分数50%的乙醇水溶液（用量6.8 BV），收集解吸液进行真空冷冻干燥，即得到紫薯结合酚提取物。

1.3.2 紫薯多酚对DPPH自由基清除率的测定 在具塞试管中分别加入以50%乙醇溶解的不同浓度的游离酚和结合酚提取物2.0 mL，再加入1.0×10-4 mol/L的DPPH無水乙醇溶液2.0 mL，混匀后在室温下避光反应20 min，在525 nm处测定其吸光度值Asample，同时用抗坏血酸作为阳性对照，按照下列公式计算DPPH自由基清除率：

自由基清除率=×100%

式中：Ablank为将DPPH溶液换成无水乙醇后测定的吸光度值；Acontrol为将待测溶液换成体积分数为50%的乙醇水溶液后测定的吸光度值。

1.3.3 紫薯多酚对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定 分别将以50%乙醇溶解的不同浓度的游离酚和结合酚提取物0.1 mL与0.1 mol/L的pH值6.8的磷酸缓冲液0.4 mL混合，加入0.1 mL以pH值6.8的磷酸缓冲液配制的浓度为0.005 g/mL的α-葡萄糖苷酶液，于37 ℃水浴中保温10 min，再加入0.4 mL浓度为5 mmol/L的PNPG溶液（以pH值6.8的磷酸缓冲液配制），继续水浴30 min，用2.0 mL浓度为1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，取此反应液0.5 mL，再加入蒸馏水稀释至5.0 mL，在400 nm下测定吸光值Asample，同时用阿卡波糖作为阳性对照，按照下列公式计算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

α-葡萄糖苷酶抑制活性=×100%

式中：Ablank为将酶液换为0.1 mL磷酸缓冲液后测定的吸光度值；Acontrol为将待测液换为0.1 mL 50%乙醇水溶液后测定的吸光度值。

1.3.4 体外模拟胃肠消化过程中紫薯多酚稳定性的测定 1） 样液配制。以体积分数50%的乙醇分别溶解游离酚和结合酚提取物并定容，配制浓度为12 mg/mL的游离酚提取物待测液和100 mg/mL的结合酚提取物待测液。2） 模拟胃肠消化。取两支比色管，分别加入4.0 mL生理盐水和4.0 mL胃液，混匀，以0.1 mol/L的HCl溶液调整pH值至2.0～2.5，于37 ℃下100

r/min摇床振荡1 h，其中一支以生理盐水定容至10.0 mL进行测定，另一支以1.0 mol/L NaHCO3溶液调节pH值至7.0～7.5，再加入1.8 mL肠液，于37 ℃下100 r/min摇床振荡2 h，以生理盐水定容至20.0 mL进行测定。通过测定模拟胃液和肠液消化前后紫薯多酚类物质含量的变化，研究各种游离酚和结合酚提取物中各酚类物质的稳定性。

1.3.5 多酚含量的测定 1） 标准曲线绘制。精确称取没食子酸0.1 g，用蒸馏水配制成1mg/mL的溶液，分别吸取该溶液0，0.3，0.5，1.0，1.2，1.5 mL于10.0 mL刻度试管中，用蒸馏水定容摇匀。然后从各浓度溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL刻度试管中，分别用蒸馏水定容到5.0 mL，再加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，加入0.5 mol/L碳酸钠溶液1.0 mL，摇匀后放置1 h，于725 nm下测定吸光度，平行测定3次。2） 样品测定。取样液0.5 mL，参照上述标准曲线制作方法进行测定，通过标准曲线计算其中多酚类化合物的含量。

1.3.6 黄酮含量的测定 1） 标准曲线绘制。称取芦丁标准品20.0 mg，用体积分数60%的乙醇配制成0.25 mg/mL的溶液，分别吸取该溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，

4.0 mL于10.0 mL刻度试管中，用体积分数60%的乙醇定容，再从各溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL刻度试管中，加体积分数60%的乙醇至5.0 mL，加0.3 mL 5%的NaNO2，混匀后避光静置6 min，加0.3 mL 10%的Al（NO3）3，混匀后避光静置6 min，最后加入4.0 mL 4%的NaOH溶液，用体积分数60%的乙醇定容至10.0 mL，混匀，避光反应15 min，于510 nm下测定吸光度，平行測定3次。2） 样品测定。取样液0.5 mL，参照上述标准曲线制作方法进行测定，通过标准曲线计算其中黄酮类化合物的含量。

1.3.7 酚酸含量的测定 1） 标准曲线绘制。称取绿原酸标准品20 mg，用无水乙醇配制成0.25 mg/mL的溶液，分别吸取该溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于10.0 mL刻度试管中，用无水乙醇定容。然后从各溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL容量瓶中，加5.0 mL无水乙醇，再分别加入2.0 mL 0.3%的十二烷基硫酸钠、1.0 mL 1%的三氯化铁、1.0 mL 1%的铁氰化钾，用0.1 mol/L的盐酸定容至10.0 mL，放置于避光处反应20 min，于740 nm下测定吸光度，平行测定3次。2） 样品测定。取样液0.5 mL，参照上述标准曲线制作方法，通过标准曲线计算其酚酸类化合物含量。

1.3.8 花色苷含量的测定 将样品分别用pH值1.0的0.025 mol/L的氯化钾和pH值4.5的0.4 mol/L的乙酸钠稀释，放置15 min后分别于530 mm和700 nm处测定吸光度，以样品用蒸馏水稀释后在530 nm和700 nm处的吸光度作为空白，平行测定3次。按照下列公式计算总吸光度和花色苷浓度：

总吸光度OD=（OD530 nm-OD700 nm）pH 1.0-（OD530 nm-

OD700 nm）pH 4.5

花色苷浓度（以矢车菊-3-葡萄糖苷计，mg/mL）=

式中：OD为总吸光度；MW为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子量，449.2 g/mol；DF为稀释倍数；l为比色杯的宽度，1 cm；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26 900 L/（mol·cm）。

2 结果与分析

2.1 紫薯多酚对DPPH自由基的清除效果

不同物质对DPPH自由基的清除率如图1所示。

由图1可以看出：紫薯游离酚与结合酚提取物均具有较强的DPPH自由基清除能力，且随着浓度增大，其对DPPH自由基的清除率逐渐提高。其中，游离酚提取物浓度在0.010～0.040 mg/mL范围内变化时，其对DPPH自由基的清除率随浓度增大迅速提高；当浓度达到0.040 mg/mL以后，其对DPPH自由基清除率提高幅度不明显。利用SPSS软件计算得到游离酚清除DPPH的IC50为0.014 mg/mL，当浓度达到0.045 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达到90.39%±0.22%。与紫薯游离酚相比，紫薯结合酚对DPPH自由基的清除率较低，其IC50为2.020

mg/mL，当结合酚浓度达到5.000 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达到85.16%±0.29%。

2.2 紫薯多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

不同物质对α-葡萄糖苷酶的抑制率如图2所示。

由图2可以看出：随着紫薯游离酚与结合酚提取物浓度增加，它们对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均增强。其中，紫薯游离酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性更强，利用SPSS软件计算得出游离酚抑制酶活性的IC50为0.160 mg/mL；紫薯结合酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性虽低于紫薯游离酚，但与对照品阿卡波糖相近，说明其对酶的抑制活性也较好，利用SPSS软件计算得出其IC50为0.980 mg/mL。

2.3 紫薯多酚体外模拟胃肠消化过程中的稳定性

2.3.1 紫薯游离酚稳定性 紫薯游离酚在体外模拟胃肠消化过程中的含量变化情况见表1。

由表1可知：在胃中胃酸和消化酶的作用下，总酚、黄酮、花色苷、酚酸的含量均呈下降趋势，分别下降了78.03%，85.25%，42.65%，85.35%；在肠消化酶的作用下，总酚、黄酮、花色苷的含量继续下降，分别下降了6.40%，13.04%，74.39%，而酚酸含量则有一定程度的上升，可能是其他酚类物质在肠道内分解成酚酸所致。比较各多酚类物质在胃和肠中的含量下降幅度可知，胃内消化对紫薯游离酚中总酚、黄酮和酚酸的降解大于肠内消化，但花色苷在肠中降解程度大于胃中。

2.3.2 紫薯结合酚稳定性 紫薯结合酚在体外模拟胃肠消化过程中的含量变化情况见表2。

由表2可知：在胃中胃酸和消化酶的作用下，总酚、黄酮、花色苷、酚酸的含量均呈下降趋势，分别下降了33.85%，45.24%，89.29%，15.00%，其中以花色苷含量下降幅度最大；经肠消化2 h后，总酚含量继续下降，而黄酮、花色苷、酚酸特别是花色苷的含量呈一定程度的上升，说明肠液的消化促进了它们从与其他物质的结合状态下进一步释放出来。

3 结论

1） 经树脂纯化后的紫薯游离酚和结合酚提取物具有较强的DPPH自由基清除活性，其半数抑制浓度（IC50）分别为0.014 mg/mL和2.020 mg/mL，游离酚的活性强于结合酚，当游离酚提取浓度达到0.040 mg/mL时，其清除DPPH自由基的活性接近相同浓度的抗坏血酸（对照）。

2） 紫薯游离酚与结合酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分别为0.160 mg/mL和0.980 mg/mL，紫薯游离酚提取物活性要优于阿卡波糖（对照），而结合酚提取物活性则与阿卡波糖相近。

3） 体外模拟胃肠消化过程中的稳定性测定结果表明，紫薯游离酚类物质在胃中消化过程中含量下降幅度较大，而肠液对其含量下降影響较小；与游离酚相比，紫薯结合酚类物质（花色苷除外）含量在胃中下降幅度较小，而在肠消化过程中还会呈一定程度的上升趋势。

参考文献

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