植物病毒病检测及防治技术研究进展

摘  要：植物病毒病与其他植物病害相比，具有危害大、难检测、难防治的特点。本文结合植物病毒病的发生特点综述了植物病毒病检测及防治技术，并对植物病毒病的防治工作进行了展望。

关键词：植物病毒病;检测;防治;技术研究

中图分类号 S432 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）12-0079-4

Abstract：It"s more devastating and difficult to detect the pathogen and manage plant virus disease efficiently than other diseases. The occurring characteristics of plant virus disease are pointed out，and some progresses in detection technology and management technology are reviewed in this paper. At last，the future work of management technology of plant virus disease is prospected.

Key words：Plant virus disease;Detection technology;Management technology

在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第2大类植物病害，世界各地的绝大部分作物都不同程度受其危害。植物病毒在植物细胞中绝对寄生，其复制所需的物质、能量、场所完全由寄主细胞提供。由于植物没有完整的免疫系统，植物病毒病的防治较为困难，一直是植物病害及病毒学研究的难点和热点问题[1]。

植物病毒必须在寄主细胞内营寄生生活，所以一般植物病毒只有在寄主活体内才具有活性。仅少数植物病毒可在病株残体中保持活性几天乃至几年，也有少数植物病毒可在昆虫活体内存活或增殖。植物病毒专化性强，某一种病毒只能侵染某一种或某些植物，但也有少数为害广泛，如烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等。植物病毒在寄主细胞中进行核酸（RNA或DNA）和蛋白质外壳的复制，组成新的病毒粒体。植物病毒粒体或病毒核酸在植物细胞间转移速度很慢，而在维管束中则可随植物的营养流动方向而迅速转移，造成全株发病。

植物病毒的传播方式主要有繁殖材料传播、机械汁液传播、媒介传播等。病毒病为全株性侵染，染病植株的种子、块茎、接穗、腋芽等各个部位都带有病毒。病毒将通过这些繁殖材料进行传播扩散;植物病毒可以通过机械伤口侵染健康植株，机械摩擦、修剪、移苗都可能导致植物病毒随汁液传播;植物病毒病的流行依赖于载体的传播，这些载体包括昆虫、土壤中的线虫、真菌，这其中近80%依赖于特定的媒介昆虫传播;这些媒介昆虫大部分为同翅目的刺吸式口器昆虫，如蚜虫、粉虱、飞虱、木虱、叶蝉、介壳虫等[2]。

1 植物病毒病的检测技术

病毒有2大类，以DNA为遗传物质的病毒叫DNA病毒，以RNA为遗传物质的病毒叫RNA病毒，90%的植物病毒为RNA病毒。早期RNA植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法（指示植物检测法），即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式将待检测带毒植株的汁液接种到一种或几种指示植物上，观察其在指示植物上表现出的症状来进行检测的方法。指示植物就是指能对某一种或某几种病毒及类病毒敏感，被感染后能很快表现出明显症状的植物。传统的生物学方法鉴定谱广、操作简单，但需要培育大量的指示植物，检测速度慢，且易受外界环境影响。

随着电子显微镜面世，病毒的真正形态才得以展现。电子显微镜技术观测结果直观、准确，还可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段之一[3]。但仪器设备比较昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人员技术水平要求较高。

由于每一种植物病毒产生的抗血清都有各自的特性，人们研究发明了利用抗原抗体体外特异性免疫反应检测植物病毒的方法。酶联免疫吸附法（ELISA）以酶催化的颜色反应来指示抗原抗体的结合，具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、花费少等优点，可用于大规模样品检测，是血清学技术中应用最为广泛的一种方法，已成为检测植物病毒的关键技术[4]。

随着人们对生物体遗传物质研究的逐步深入，发现通过核酸可以准确、快速地对植物、动物、微生物进行物种、种群鉴定。基于核酸检测的分子生物学方法比血清学方法检测范围更广、灵敏度更高、特异性更强，并且适合大批量的样本检测，在植物病毒检测中迅速地得以广泛应用。主要包括核酸杂交技术（Nucleic acid hybridization）、反转录PCR技术（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、荧光定量PCR技术（real-time PCR）及DNA微阵列技术（DNA microarray）[3]。核酸杂交技术根据互补的核酸单链可以重新结合的原理，将待检测病毒的一段特定序列用同位素或非放射性地高辛等加以标记制成探针，与目标病毒核酸杂交后便能指示病毒的存在。RT-PCR先把RNA反转录成cDNA，进而进行PCR扩增和杂交试验，多重RT-PCR可以实现多种病毒的同步检测，是目前广泛应用的一项分子检测技术;而荧光定量PCR技术不仅可以用于定性分析还可以用于定量检测。

2 植物病毒病的传统防治技术

结合植物病毒病的发生特点，植物病毒病的传统防治技术主要集中在脱毒种苗、媒介昆虫的防治、接种弱病毒、选育和推广抗病品种等方面。

植株体内的病毒分布存在不均匀性，即顶端分生组织（如根尖和茎尖）含病毒少或不含病毒，茎尖组织培养脱毒技术也因此应运而生。茎尖组织培养可以同时实现种苗脱毒和快速繁育两个目的，目前该技术已成功应用于甘蔗、马铃薯、芋、大蒜、百合、兰花等根茎植物健康种苗繁育。Hu利用菠萝茎尖进行分生组织培养，结果再生苗的菠萝凋萎病病毒（PMWaVs）脱毒率可达100%，為菠萝健康种苗的繁育奠定了基础[5]。

媒介昆虫是植物病毒病流行扩散的重要途径，健康种苗的培育、推广应结合媒介昆虫的防治措施才能起到事半功倍的效果。通过媒介昆虫的防治控制植物病毒病有许多成功的例子。比如通过防治褐飞虱（Nilaparvata lugens）控制水稻矮缩病毒病（rice dwarf virus，RDV），通过防治白背飞虱（Sogatella furcifera）控制南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV），通过防治烟粉虱（Bemisia tabaci）控制番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）[2，6]。何衍彪等（2013），通过诱杀田间蚂蚁防治菠萝洁粉蚧（Dysmicoccus brevipes），进而达到控制凋萎病（Mealybug wilt of pineapple，MWP）的目的[7]。

早在上世纪20年代末，人们就发现接种了弱毒株病毒之后的植物确实能对同种病毒的强毒株产生抗性，这被称为“交叉保护”现象。但是，对于大量种植的作物来说，对所有的植株逐一进行弱毒株接种需要耗费大量的人力、物力，防治成本过高。而且，并不是每一种植物病毒都存在弱毒性的株系，因此具有一定的局限性。

筛选和培育抗性品种是防治作物病虫害的有效方法，但由于植物病毒变异速度很快，非常容易突变出能克服植物抗病毒基因的新毒株，从而丧失抗性，因此通过常规选育和推广抗病品种防治植物病毒病十分困难。

3 植物病毒病防治新技术

3.1 新型植物抗病毒药剂 病毒侵入植物体内之后，利用宿主细胞里的资源，大量复制自己的基因组并制造新的蛋白质外壳，再组装起来，就形成了许多新一代的病毒颗粒，然后去感染宿主更多的细胞和器官。由于普通化学药物通常无法抑制病毒在宿主体内的复制、增殖，因此很难研制出有效的杀病毒的化学药剂。20世纪50年代前后科研人员筛选到一些能防治受感染植物的病毒复制的化学物质，但后来发现这些物质一般只能暂时抑制病毒增殖，推迟病害症状显现，停止用药后病毒又马上开始增殖，而且容易使寄主植物产生药害[1]。

随着诱导抗性研究的进展，20世纪90年代以来抗植物病毒剂的研究开发又成为一个新热点。首先是筛选出一些既对病毒表现抑制活性又对寄主与环境友好的天然活性物质，然后通过天然活性物质的作用机理指导高效、安全的抗植物病毒剂的人工合成。

至1988年，至少发现180种被子植物具有强烈抑制植物病毒侵染的作用，它们主要分布于商陆科、藜科、苋科、紫茉莉科等植物中[1]。随着现代化学分析技术的不断进步、完善，天然抗植物病毒抑制剂的活性成分不断被发现。例如中草药丁香所富含的丁香酚不仅对真菌、细菌有良好的抑制作用，还对西葫芦病毒病、番茄黄化曲叶病等有良好的治疗效果[8，9]。目前，植物中报道较多的抗植物病毒活性物质是多肽、酶等碱性蛋白或蛋白类似物;而微生物及其次级代谢产物的抗植物病毒活性物质多为糖类[1，10]。

李丹等（2009）对采自云南的17种大型食用真菌子实体的浸提液及其多糖组分，用半叶法在心叶烟上分别从预防（施用提取物24h后接种病毒）、钝化（提取物与病毒混合后接种）、治疗（接种病毒24h后施用提取物）3个方面进行抗烟草花叶病毒TMV活性检测。发现实验真菌的治疗效果总体不如钝化效果明显，多糖组分可能是抑制TMV的主要活性成分[11]。

活性成分研究的目的是形成产品，并服务于生产。2001年，贵州大学绿色农药与农业生物工程重点实验室、精细化工研究开发中心联合开发了含氟氨基膦酸酯类抗植物病毒剂，该产品对烟草、黄瓜、番茄等作物病毒病具有良好的防治效果[12]。2014年，中国农科院植保所基于细极链格孢（Alternaria tenuissima）的主效蛋白激发子PeaT1和Hrip1，通过与氨基寡糖素科学配伍而研制出我国第1个植物免疫蛋白制剂“阿泰灵”。该产品的蛋白激发子PeaT1和Hrip1能提高植物体内相关防卫基因的表达，对番茄黄化曲叶病、南方水稻黑条矮缩病等有良好的防治效果[13]。目前通过化学合成具有抗植物病毒活性的化合物，从结构上来看，主要包括即杂环类、核苷酸、生物碱、取代苯、醛类及其缩合物、有机磷、氨基酸衍生物等[1]。据不完全统计，我国目前登记防治农作物病毒病的药剂共有169件，主要包含菌毒清、宁南霉素、盐酸吗啉胍、菇类蛋白多糖、氨基寡糖素等14个单剂和复配剂。

3.2 基因工程技术 病毒侵染植物后会产生大量病毒来源的小RNA（virus-derived small interfering RNAs，vsiRNA），可以通过介导对这些病毒RNA的降解或抑制病毒基因的转录来抵抗病毒侵染。植物抗病毒过程是RNA沉默介导的病毒RNA与所转病毒基因的mRNA均被降解的过程[14]。随着近年来RNA干扰机制研究的不断深入，利用RNA干扰的高效性和特异性来控制植物的病毒病已开始得到科学家们的重视，并取得了一定的成效[15]。

1986年，华盛顿大学的Powell通过基因工程技术，首次将烟草花叶病毒外壳蛋白（CP）基因转入烟草，培育出能稳定遗传的抗TMV的植株[16]。刘玉乐等（1993）在世界上首次应用黄瓜花叶病毒（CMV）致弱satRNA防治黄瓜花叶病毒获得成功，将合成的R1分离物satRNA的cDNA导入烟草中，发现该烟草可有效地阻止CMV的侵染[17]。

朱俊华等（2004）把烟草马铃薯Y病毒（PVY）外壳蛋白基因片段的反向重复序列导入烟草，获得了对PVY免疫的植株[18]。牛颜冰等（2005）将番茄花叶病毒移动蛋白基因（ToMV-MP）的反向重复结构转化烟草，在所得47株转基因烟草中有23株对ToMV具有免疫作用;将烟草花叶病毒部分复制酶基因（CMV-ΔRep）的反向重复结构转化烟草，在所得40株转基因烟草中有25株对CMV具有免疫作用[19]。Huang等（2009）在烟草上用DNA1作为载体沉默了AtTOM的同源基因NbTOM1和NbTOM3，发现对AtTOM同源基因的沉默能夠显著抑制烟草花叶病毒的增殖[20]。

目前世界上已被获准商品化种植的抗病毒转基因作物有木瓜、马铃薯（2001年因销路不佳不再销售）、葫芦瓜（转基因所占比例13%）等。我国也培育出了多种抗病毒转基因作物，已获得安全证书的转基因作物有7种，但目前仅有辣椒、木瓜获得农业转基因生物安全证书，其中转基因木瓜已在广东省商品化种植。

4 展望

尽管国内外科研人员成功研制了一系列新型植物抗病毒药剂，但其规模、数量远远落后于杀虫剂、杀菌剂，且大多数表现为保护作用，对植物病毒病的治疗效果还不是十分理想。但以环境友好的天然物活性物质为先导，开发“新型、高效、安全”的农药品种依然是今后植物抗病毒药剂的发展方向。基因工程技术为植物病毒病的防治提供了新的手段，但转基因抗病品种仍然面临变异病毒、外来病毒的挑战，加上人们对转基因食品的安全性认识还不统一，其在植物病毒病，尤其是粮食、水果、蔬菜病毒病的防治上的应用还有很长的路要走。

植物病虫害的防治须遵循“预防为主，综合防治”的植保方针。人们对植物病毒病的认识相对较少，今后除了在不断探索新的基因工程技术、研制新型植物抗病毒药剂之余，还需要加强植物检疫工作，继续开展脱毒种苗、媒介昆虫的防治、接种弱病毒以及选育和推广抗病品种等传统防治技术方面的研究。

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（责编：杨 林）

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