白花地胆草对常见细菌抑制作用的研究

工作台、ＳＰＸ－２７０型培养箱、ＲＥ－５２Ｄ旋转蒸发器等。

１．４培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基和液体培养基。

１．５方法

１．５．１白花地胆草水煎煮液的制备称取１００ ｇ白花地胆草，剪碎并研磨，加入５００ ｍＬ蒸馏水，浸泡３０ ｍｉｎ，小火煮沸３０ ｍｉｎ，抽滤得滤液，药渣再加５００ ｍＬ蒸馏水，小火煮沸３０ ｍｉｎ，再次抽滤得滤液，合并两次滤液，然后小火加热蒸发浓缩至１００ ｍＬ，制成含生药量为１ ｇ／ｍＬ白花地胆草水煎煮液，４℃保存待用。

１．５．２白花地胆草乙醇提取液的制备称取１００ ｇ白花地胆草，剪碎并研磨，加入５００ ｍＬ ９５％乙醇，浸泡３ ｈ后，抽滤得滤液，药渣再加５００ ｍＬ ９５％乙醇，浸泡３ ｈ后，再次抽滤得滤液，合并两次滤液，用低温（≤６０℃）减压蒸馏回收乙醇，浓缩制成含生药量为１ ｇ／ｍＬ的白花地胆草乙醇提取液，４℃保存待用。

１．５．３菌悬液的制备［９］将供试菌种分别接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化后，进行平板菌落计数，根据计算结果用无菌生理盐水将菌液调至约为１０６CFU／ｍＬ，４℃保存待用。

１．５．４抑菌实验方法

１）抑菌圈大小测定［１０，１１］。用无菌刻度吸管吸取１ ｍＬ供试菌液置于无菌培养皿中，再倒入融化并冷却至５０℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约１５ ｍＬ，轻轻转动培养皿，使菌液与培养基混匀，冷凝制成平板。分别将含生药量为１ ｇ／ｍＬ的白花地胆草水煎煮液（无菌水溶解）和乙醇提取液（乙醇溶解）加无菌水稀释成浓度为０．８、０．６、０．４、０．２、０ ｇ／ｍＬ（对照）的药液。用无菌镊子将直径为６ ｍｍ的灭菌干燥滤纸片分别放入装有各浓度药液的培养皿中浸泡３０ ｍｉｎ，然后取出滤纸片，在培养皿内壁上滤去多余药液，将滤纸片贴于上述平板表面，每皿贴３片，每菌每种浓度重复做３次，贴好滤纸片的平板在室温下放置２０ ｍｉｎ后倒置于３７℃培养２４ ｈ，取出测定抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。

２）最小抑菌浓度（ＭＩＣ）测定。采用试管２倍稀释法测定ＭＩＣ［１１］。取１０支灭菌试管，各管分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基１ ｍＬ，在第１管中加入１ ｍＬ灭菌的１ ｇ／ｍＬ白花地胆草提取液，混匀后吸取１ ｍＬ加入到第２管中，依此类推，直至第８管，第８管吸取１ ｍＬ弃去，使其成１∶２、１∶４、１∶８等浓度梯度。向１－８管中分别加入０．０５ ｍＬ菌液，第９管只加菌液０．０５ ｍＬ作为对照，以观察细菌生长情况。第１０管只加提取液１ ｍＬ，以观察提取液是否被污染。重复实验３次，将各管置于３７℃培养２４ ｈ，观察结果，以无菌生长的最低稀释度为ＭＩＣ。

３）温度对抑菌效果影响测定。将浓度为０．５ ｇ／ｍＬ的两种白花地胆草提取液经１２１℃高压蒸汽灭菌后，用滤纸片法测定抑菌圈直径，以确定高压蒸汽灭菌对白花地胆草提取液抑菌效果的影响。

１．５．５数据分析所得实验数据采用ＳＰＳＳ １７．０软件分别进行多重比较分析和ｔ检验分析。

２结果与分析

２．１抑菌圈大小的测定结果

采用滤纸片法测定白花地胆草水煎煮液和乙醇提取液的抑菌圈直径，结果见表１。由表１可知，当白花地胆草两种提取液生药含量在０.0～１．０ ｇ／ｍＬ范围内，它们对３种细菌都有不同程度的抑制作用，而且，随着药液浓度的增大，抑制作用也逐渐增强。当提取液浓度在１．０ ｇ／ｍＬ时，两种提取液对３种细菌的抑菌圈直径都达１０．０ ｍｍ以上。当提取液浓度大于０．４ ｇ／ｍＬ时，对于同一种细菌，水煎煮液的抑制作用强于乙醇提取液。此外，当提取液浓度相同时，水煎煮液对大肠杆菌的抑菌效果最强，乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强。

２．２最小抑菌浓度的测定结果

采用试管２倍稀释法测定白花地胆草两种提取液对３种细菌的ＭＩＣ，从结果（表２）可知，白花地胆草水煎煮液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的ＭＩＣ依次为１／１６、１／８和１／３２ ｇ／ｍＬ，其乙醇提取液对上述细菌的ＭＩＣ依次为１／４、１／４和１／１６ ｇ／ｍＬ，两种提取液对金黄色葡萄球菌的ＭＩＣ均小于其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的ＭＩＣ，对于同一种细菌，水煎煮液的ＭＩＣ低于乙醇提取液的ＭＩＣ。

２．３温度对抑菌效果影响的测定结果

白花地胆草两种提取液灭菌前后对供试细菌的抑菌圈直径见表３。表３结果表明，白花地胆草两种提取液中的抑菌物质热稳定性较好，经１２１℃高压蒸汽灭菌处理后，水煎煮液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前有极显著增强，乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前也稍有增强，灭菌前后两种提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用变化不明显。其原因可能是高温加热灭菌过程中，不同成分间发生了一系列化学反应，生成了新的抗菌物质，而不同细菌对这类抗菌物质的耐性存在差异。

３讨论

本实验结果表明，白花地胆草两种提取液在一定浓度时，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都有良好的抑菌效果，而且，提取液经高压蒸汽灭菌后其抑菌效果并不减弱。可进一步研究这两种提取液对其他常见微生物的抑制作用，以拓展其抑菌谱，为该植物的后续研究和开发利用提供更多的依据。

白花地胆草在我国南方资源丰富、价格低廉，目前多作为民间用药，深度加工和利用极少，若能以其为原料，研制用于食品、化妆品等产品的防腐剂或开发用于畜禽疾病防治的中草药制剂，将具有广阔的前景。

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